蛋白质水解的产物（蛋白质的发现、分类、分离和提纯）

蛋白质是生命的物质基础，是构成生命的基本物质。人体一切细胞都由蛋白质组成。通俗易懂些说，它是构成人体组织器官的支架和主要物质，蛋白质是人体氮的唯一来源，在人体生命活动中，起着重要作用，可以说没有蛋白质就没有生命活动的存在，所以摄取蛋白质就显得非常重要。它能够促进机体的新陈代谢，保证机体运动和构成变体蛋白，保持组织硬度和弹性，调节生理机能和供给机体能量，是人体保持健康所必需的，也是非常重要的营养物质。

一、蛋白质的简史

蛋白质是荷兰科学家格利特·马尔德在1838年发现的。他观察到有生命的东西离开了蛋白质就不能生存。1820年H.布拉孔诺发现甘氨酸和亮氨酸，这是最初被鉴定为蛋白质成分的氨基酸，以后又陆续发现了其他的氨基酸。到19世纪末已经搞清蛋白质主要是由一类相当简单的有机分子——氨基酸所组成。1902年E.菲舍尔和F.霍夫迈斯特各自独立地阐明了在蛋白质分子中将氨基酸连接在一起的化学键是肽键；1907年E.菲舍尔又成功地用化学方法连接了18个氨基酸首次合成了多肽，从而建立了作为蛋白质化学结构基础的多肽理论。1960 年J.C.肯德鲁首次应用X射线衍射分析技术测定了肌红蛋白的晶体结构。

中国科学工作者在1965年用化学合成法全合成了结晶牛胰岛素，首次实现了蛋白质的人工合成；在1969～1973年期间，先后在2.5埃和1.8埃分辨率水平测定了猪胰岛素的晶体结构，这是中国阐明的第一个蛋白质的三维结构。

二、蛋白质的来源

蛋白质的主要来源是肉、蛋、奶、和豆类食品，一般而言，来自于动物的蛋白质有较高的品质，含有充足的必需氨基酸。植物性蛋白质通常会有1-2种必需氨基酸含量不足，所以素食者需要摄取多样化的食物，从各种组合中获得足够的必需氨基酸。一块像扑克牌大小的煮熟的肉约含有30-35克的蛋白质，一大杯牛奶约有8-10克，半杯的各式豆类约含有6-8克。所以一天吃一块像扑克牌大小的肉，喝两大杯牛奶，一些豆子，加上少量来自于蔬菜水果和饭，就可得到大约60-70克的蛋白质，足够一个体重60公斤的长跑选手所需。若是你的需求量比较大，可以多喝一杯牛奶，或是酌量多吃些肉类，就可获得充分的蛋白质。

三、蛋白质用途

蛋白质是人类和其他动物的主要食物成分，高蛋白膳食是人民生活水平提高的重要标志之一。许多纯的蛋白质制剂也是有效的药物，例如胰岛素、人丙种球蛋白和一些酶制剂等。在临床检验方面，测定有关酶的活力和某些蛋白质的变化可以作为一些疾病临床诊断的指标，例如乳酸脱氢酶同工酶的鉴定可以用作心肌梗塞的指标，甲胎蛋白的升高可以作为早期肝癌病变的指标等。在工业生产上，某些蛋白质是食品工业及轻工业的重要原料，如羊毛和蚕丝都是蛋白质，皮革是经过处理的胶原蛋白。在制革、制药、缫丝等工业部门应用各种酶制剂后，可以提高生产效率和产品质量。蛋白质在农业、畜牧业、水产养殖业方面的重要性，也是显而易见的。

四、蛋白质的分类

蛋白质种类繁多，结构复杂，主要由氨基酸组成，因氨基酸的组合排列不同而组成各种类型的蛋白质。蛋白是蛋白质，蛋黄也是蛋白质。蚕丝是蛋白质，羊毛是蛋白质，鹿角是蛋白质，鱼鳞是蛋白质，鸟的羽毛以及人的头发、指甲、肌肉也是蛋白质。甚至连酶、很多激素以及天花、麻疹、流感病毒，也是蛋白质。人体中大约有几千种蛋白质。

⒈根据所含氨基酸的种类和数量分

⑴ 完全蛋白质：这是一类优质蛋白质。它们所含的必需氨基酸种类齐全，数量充足，彼此比例适当。这一类蛋白质不但可以维持人体健康，还可以促进生长发育。奶、蛋、鱼、肝脏、酵母、黄豆、肉中的蛋白质都属于完全蛋白质，植物中的大豆亦含有完全蛋白质。

⑵ 半完全蛋白质：这类蛋白质所含氨基酸虽然种类齐全，但其中某些氨基酸的数量不能满足人体的需要。它们可以维持生命，但不能促进生长发育。例如，小麦中的麦胶蛋白便是半完全蛋白质，含赖氨酸很少。食物中所含与人体所需相比有差距的某一种或某几种氨基酸叫做限制氨基酸。谷类蛋白质中赖氨酸含量多半较少，所以，它们的限制氨基酸是赖氨酸。

⑶不完全蛋白质：这类蛋白质不能提供人体所需的全部必需氨基酸，其所含氨基酸种类不全，单纯靠它们既不能促进生长发育，也不能维持生命。如谷、麦类、玉米所含的蛋白质和动物皮骨中的明胶等。

⒉ 根据蛋白质分子的外形分

⑴ 球状蛋白质：形状接近球形，水溶性较好，种类很多，可行使多种多样的生物学功能。

⑵ 纤维状蛋白质：分子对称性差，外形呈棒状或纤维状，溶解性质各不相同，大多数不溶于水，如胶原蛋白、角蛋白等。有些则溶于水，如肌球蛋白、血纤维蛋白原等。是生物体重要的结构成分，或对生物体起保护作用。

⑶ 膜蛋白质：一般折叠成近球形，插入生物膜，也有一些通过非共价键或共价键结合在生物膜的表面。生物膜的多数功能是通过膜蛋白实现的。

⒊ 按化学结构、形状及营养价值分

⑴ 按化学结构：可将蛋白质分为单纯蛋白质(纯为α-氨基酸所组成)与结合蛋白质(单纯蛋白质与非蛋白质分子结合而成)两大类。前者如清蛋白、球蛋白、谷蛋白等，水解后的最终产物只是氨基酸；后者如核蛋白、糖蛋白、脂蛋白等，水解后还有其所含的非蛋白质分子(辅基)。

⑵ 按蛋白质形状：可将蛋白质分为纤维状蛋白质和球状蛋白质。前者多为结构蛋白，是形成机体组织的物质基础，如胶原蛋白等；后者多用以合成生物活性因子，如酶、激素、免疫因子、补体等。

⑶ 按营养价值：可将蛋白质分为完全蛋白质、半完全蛋白质和不完全蛋白质。

⒋ 根据化学组成分

⑴ 简单蛋白质

分子中只含有氨基酸，没有其它成分。

① 清蛋白 又称白蛋白，分子量较小，溶于水、中性盐类、稀酸和稀碱，可被饱和硫酸铵沉淀。清蛋白在自然界分布广泛，如小麦种子中的麦清蛋白、血液中的血清清蛋白和鸡蛋中的卵清蛋白等都属于清蛋白。

② 球蛋白 分子比较对称，接近球形或椭球形。含有折叠紧密的多肽链的一类蛋白质，一般不溶于水而溶于稀盐溶液、稀酸或稀碱溶液，可被半饱和的硫酸铵沉淀。球蛋白在生物界广泛存在并具有重要的生物功能。大多数蛋白质属于球状蛋白质，如大豆种子中的豆球蛋白、血液中的血清球蛋白、肌肉中的肌球蛋白以及免疫球蛋白都属于这一类。

③ 组蛋白 可溶于水或稀酸。组蛋白是染色体的结构蛋白，含有丰富的精氨酸和赖氨酸， 所以是一类碱性蛋白质。

④ 精蛋白 是一类分子量较小结构简单的蛋白质，易溶于水或稀酸。精蛋白含有较多的碱性氨基酸，缺少色氨酸和酪氨酸，所以是一类碱性蛋白质。精蛋白存在于成熟的精细胞中， 与DNA结合在一起，如鱼精蛋白。

⑤ 醇溶蛋白 不溶于水和盐溶液，溶于70%～80%的乙醇，多存在于禾本科作物的种子中，如玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白。

⑥ 谷蛋白 不溶于水、稀盐溶液，溶于稀酸和稀碱。谷蛋白存在于植物种子中，如水稻种子中的稻谷蛋白和小麦种子中的麦谷蛋白等。

⑦ 硬蛋白 不溶于水、盐溶液、稀酸、稀碱，主要存在于皮肤、毛发、指甲中，起支持和保护作用，如角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白等。

⑵ 结合蛋白质

是由蛋白质部分和非蛋白质部分结合而成。主要的结合蛋白有六种：

① 核蛋白 非蛋白部分为核酸称核蛋白。 分布广泛，存在于所有生物细胞中。

② 糖蛋白 非蛋白部分为糖类称糖蛋白。 广泛存在于动物、植物、真菌、细菌及病毒中。

③ 脂蛋白 蛋白质和脂类结合构成脂蛋白。在脂蛋白中，脂类和蛋白质之间以非共价键结合。广泛分布于细胞和血液中。

④ 色蛋白 蛋白质和某些色素物质结合形成色蛋白。非蛋白质部分多为血红素，所以又称为血红素蛋白。

⑤ 金属蛋白 是一类直接与金属结合的蛋白质，如铁蛋白含铁；乙醇脱氢酶含锌，黄嘌呤氧化酶含钼和铁等。

⑥ 磷蛋白 分子中含磷酸基，一般磷酸基与蛋白质分子中的丝氨酸或苏氨酸通过酯键相连。如酪蛋白、胃蛋白酶等都属于这类蛋白。

⒌ 按需求情况分

食物中的蛋白质必须经过肠胃道消化，分解成氨基酸才能被人体吸收利用，人体对蛋白质的需要实际就是对氨基酸的需要。吸收后的氨基酸只有在数量和种类上都能满足人体需要身体才能利用它们合成自身的蛋白质。

⑴ 必需氨基酸

必需氨基酸指的是人体自身不能合成或合成速度不能满足人体需要，必须从食物中摄取的氨基酸。对成人来说，这类氨基酸有8种，包括赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸。对婴儿来说，有9种，多一种组氨酸。若是体内有一种必需氨基酸存量不足，就无法合成充分的蛋白质供给身体各组织使用，其他过剩的蛋白质也会被身体代谢而浪费掉，所以确保足够的必需氨基酸摄取是很重要的。

⑵ 非必需氨基酸

非必需氨基酸并不是说人体不需要这些氨基酸，而是说人体可以自身合成或由其它氨基酸转化而得到，不一定非从食物直接摄取不可。这类氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸（及其胺）、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、胱氨酸。有些非必需氨基酸如胱氨酸和酪氨酸如果供给充裕还可以节省必需氨基酸中蛋氨酸和苯丙氨酸的需要量。

五、蛋白质的分离纯化

许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提是一项复杂的工作。蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。

1、原料的选择

选取适当的含该种蛋白质量丰富的食品或其它材料

2、预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。常用的破碎组织细胞的方法有：

⑴ 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

⑵ 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

⑶ 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

⑷ 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

⑸ 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

3、 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。 抽提所用缓冲液的pH、 离子强度、 组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。清蛋白可用水来提取；球蛋白可以用中性盐溶液提取；谷蛋白可用稀酸或稀碱提取；醇溶液谷蛋白则用适当浓度的乙醇来提取等。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在提取过程中，必须保持低温，降低降解酶的作用。一般接近0℃时提取。避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

4、 蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：

⑴等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

⑵盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

⑶有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

5、蛋白质的纯化

用等电点沉淀法、盐析法，所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。有时需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。常用的纯化方法有：

⑴凝胶过滤法

又叫分子筛分离法。它主要是利用具有多孔性的网状结构的凝胶的分子筛，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的。它允许大颗粒通过而保持住小颗粒，因此能使大小不同的蛋白质分子通过凝胶彼此分开。该方法适用于水溶性高分子物质如蛋白质、酶、核酸、激素等的分离纯化。

此法有如下的优点：

① 分离条件温和，因此，不稳定的分子也能用此法分离。

② 样品回收率高，几乎可达 100%。

③ 实验的重复性高。

④ 完成操作的时间相对来说比较短，所需要的设备简便、经济。

⑵离子交换层析法

是一种常用的分离纯化的方法。最常用的是使用各种类型的离子交换剂的柱层析法。如果带电基团带负电，则能结合阳离子，称为阳离子交换剂；如果带电基团呈正电，则能结合阴离子，称为阴离子交换剂。通常使用各种改良的纤维离子交换剂。这是经过化学处理而附加上各种离子化基团的纤维，例如阴离子交换剂DEAE——纤维素（即二乙氨乙基纤维素）和阳离子交换剂CM——纤维素（羧甲基纤维素）等。

对于蛋白质分子既带正电荷，也带负电荷。如果提高pH，这些分子带负电；降低pH，则带正电；在等电点处，分子含相等数目的正、负电荷。这个性质对蛋白质的纯化有很大的好处。例如，可以将蛋白质混合物的pH调到某一点，在此pH下，所要的那个蛋白质在溶液中带正电荷，这时，如果混合物在阳离子交换剂上层析，则很多阳离子蛋白质就可除去。此后，提高pH，将所要蛋白质溶液中变成负电荷，再在阴离子交换剂上层析，这样又可除去好多阴离子成分。

⑶电泳法

电泳的方法很多， 已经为鉴定生物大分子并分析它们的纯度的基本工具。 此法是根据蛋白质分子具有可电离的基团，在溶液中能够形成带电荷的离子，因而，它们在电场的作用下就会发生移动。由于各种蛋白质分子所带静电荷的多少不同，使蛋白质达到纯化。